近年来,snoRNA已成为疾病领域特别是癌症领域的研究热点。snoRNA在血液、痰液以及尿液中稳定存在,是高潜能的疾病诊断分子标志物。Arraystar公司最新推出的nrStar™HumansnoRNAPCRArray,包含了359条从权威数据库SnoPY与snoRNA-LBME-db精心挑选的snoRNA,是目前市场上snoRNA覆盖度最高的PCR芯片,是进行snoRNA表达检测与功能研究必不可少的工具。
     核仁小RNA(snoRNA)是一类中等长度的非编码小RNA分子,其长度60-300nt不等,是snoRNPs复合物的主要成员之一[1]。在snoRNP复合物中,snoRNA通过碱基互补原理识别rRNA上的特定位点,引导复合物对这些位点进行2'-O甲基化和假尿嘧啶化修饰。在脊椎动物中,核仁小RNA的编码基因主要位于蛋白编码基因的内含子区,其转录产物经转录后加工形成成熟的核仁小RNA[2]。snoRNA参与多种生物学过程,包括rRNA的加工处理,RNA剪接和翻译,以及对氧化应激反应的调控[3]。根据snoRNA结构与功能的不同,可将snoRNA分为两大类:负责2'-O甲基化的boxC/DsnoRNA和负责假尿嘧啶化的boxH/ACAsnoRNA[1]。另外,还存在一类比较特殊的snoRNA—scaRNAs。scaRNAs特异表达于细胞核的Cajal小体,具有类似的C/Dbox或H/ACAbox结构[4]。snoRNA还产生类似miRNA的短片段非编码RNA,可与AGO蛋白结合并识别靶向mRNA序列,调控其翻译过程[5]
     多项研究表明,snoRNA在肿瘤中异常表达,并在肿瘤转移过程中扮演着重要角色。有些snoRNA可作为肿瘤促进剂或抑制剂发挥功能[6-7]。例如,SNORD50A/B具有结合K-Ras并抑制其活性的功能,常在癌症中发生缺失突变[8];SNORD44(RNU44)和SNORD43(RNU43)与乳腺癌的不良预后有关[9];SNORA80E(SNORA42)在肺癌中作为癌基因存在,抑制SNORA42的表达能够产生明显的抗癌作用[10]。C/DBox类snoRNAs在癌症中普遍高表达[11]。此外,snoRNA在神经退行性疾病的发生发展过程也发挥着关键作用。

nrStar™HumanFunctionalLncRNAPCRArray服务列表
芯片特点
• 最佳覆盖范围—同一块384孔板上覆盖了snoRNA,snoRNA靶向snRNA以及snoRNP复合物成员,是目前市场上覆盖度最高的PCR芯片
• 无与伦比的灵敏度–只需50ng总RNA,无需扩增
• 稳定有效的PCR引物–所有引物均在不同的细胞组织样本中通过严格验证
• 简单快速–无需扩增,只需将反转好的CDNA与SYBR®Greenmastermix混合加入到板中,然后运行qPCR,4小时内即能得到实验结果
• 疾病分子标志物筛选–高覆盖度、灵敏度、准确率以及高通量使其成为疾病分子标志物筛选与验证的首选

PCR芯片所包含的snoRNA列表
SnoPY:http://snoopy.med.miyazaki-u.ac.jp/
snoRNA-LBME-db:https://www-snorna.biotoul.fr//
 

服务名称芯片规格描述
nrStar™HumansnoRNAPCRArrayServicenrStar™HumansnoRNAPCRArray384-wellplate359条snoRNA,7条snoRNA靶向snRNA和4条snoRNPs复合物成员mRNA

PCR芯片实验流程
1. RNA抽提与质量检测
进行RNA常规抽提,使用NanodropND-1000检测RNA浓度和纯度,使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。详细的样品QC结果见Arraystar服务报告。
2. cDNA合成
每样本取1.5μgRNA,使用rtStar™First-StrandSynthesisKit(Cat#AS-FS-001,Arraystar)试剂盒合成cDNA第一链。详细步骤参照Arraystar产品操作手册。
3. Real-timePCR扩增
将cDNA与ArraystarSYBRGreenqPCRMasterMix(Cat#AS-MR-005-5,Arraystar)混合,加入至384孔板中,在ABI7900PCR仪上进行Real-timePCR扩增。
4. 熔解曲线分析与原始数据导出
PCR扩增完成后,进行熔解曲线分析,使用PCR仪自带软件导出原始数据。出具RawData文件夹,包含原始Ct值、PCR扩增曲线图和熔解曲线图。

PCR芯片数据分析流程
1. PCR芯片数据质控
质控参数:Ct(Blank)>35;Ct(GDC)>35;Ct(RNASpike-in)<25;Ct(PPC)<25.符合上述条件的样本进入下一步分析。
2. 数据校正与△Ct值计算
板间校正:使用Ct(PPC)对不同PCR板进行板间校正。
内参校正与△Ct值计算:挑选最优内参,使用内参均值计算△Ct值。
3. 差异倍数计算(2^(-△△Ct))
使用△△Ct方法计算不同样品组之间的表达差异倍数。
4. P值计算
对样本组进行t检验,计算P值。
5. 其他常规数据分析
散点图分析;火山图分析;TOP20表达上调和下调snoRNA柱形图分析
6. 提供服务报告与数据分析结果
a. Arraystar服务报告(包括RNA样本QC和详细实验数据分析步骤)
b. Excel芯片结果汇总表(包括snoRNA列表,数据分析结果和各类图表)
c. RawData文件夹(包含原始数据、扩增曲线图和熔解曲线图)

ArraystarsnoRNAPCR芯片服务部分结果展示
1. 差异表达snoRNA列表(默认筛选参数:差异倍数>2;P<0.05,客户可指定筛选参数值)


2. 散点图(黑色斜线代表差异倍数为1,红色斜线代表差异倍数为2)


3. 火山图(黑色垂线代表差异倍数为1;粉色垂线代表上调或下调倍数为2;蓝色水平线代表P值为0.05)


4. TOP20表达上调snoRNA柱状图


5. TOP20表达下调snoRNA柱状图


参考文献
1. EstellerM.(2011)"Non-codingRNAsinhumandisease."Nat.Rev.Genet.12(12):861-74[PMID:22094949]
2. RichardP.andT.Kiss(2006)"IntegratingsnoRNPassemblywithmRNAbiogenesis."EMBORep.7(6):590-2[PMID:16741502]
3. WilliamsG.T.andF.Farzaneh(2012)"AresnoRNAsandsnoRNAhostgenesnewplayersincancer?"Nat.Rev.Cancer12(2):84-8[PMID:22257949]
4. DarzacqX.etal.(2002)"Cajalbody-specificsmallnuclearRNAs:anovelclassof2'-O-methylationandpseudouridylationguideRNAs." EMBOJ.21(11):2746-56[PMID:12032087]
5. EnderC.etal.(2008)"AhumansnoRNAwithmicroRNA-likefunctions."Mol.Cell32(4):519-28[PMID:19026782]
6. NallarS.C.andD.V.Kalvakolanu(2013)"RegulationofsnoRNAsincancer:closeencounterswithinterferon."J.InterferonCytokineRes.   33(4):189-98[PMID:23570385]
7. MannoorK.etal.(2012)"SmallnucleolarRNAsincancer."Biochim.Biophys.Acta1826(1):121-8[PMID:22498252]
8. SiprashviliZ.etal.(2016)"ThenoncodingRNAsSNORD50AandSNORD50BbindK-Rasandarerecurrentlydeletedinhumancancer."Nat.Genet.48(1):53-8[PMID:26595770]
9. GeeH.E.etal.(2011)"Thesmall-nucleolarRNAscommonlyusedformicroRNAnormalisationcorrelatewithtumourpathologyandprognosis."Br.J.Cancer104(7):1168-77[PMID:21407217]
10. MeiY.P.etal.(2012)"SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumOrigenesis."Oncogene31(22):2794-804[PMID:21986946]
11. SuH.etal.(2014)"ElevatedsnoRNAbiogenesisisessentialinbreastcancer."Oncogene33(11):1348-58[PMID:23542174]



     近年来,snoRNA已成为疾病领域特别是癌症领域的研究热点。snoRNA在血液、痰液以及尿液中稳定存在,是高潜能的疾病诊断分子标志物。Arraystar公司最新推出的nrStar™HumansnoRNAPCRArray,包含了359条从权威数据库SnoPY与snoRNA-LBME-db精心挑选的snoRNA,是目前市场上snoRNA覆盖度最高的PCR芯片,是进行snoRNA表达检测与功能研究必不可少的工具。
     核仁小RNA(snoRNA)是一类中等长度的非编码小RNA分子,其长度60-300nt不等,是snoRNPs复合物的主要成员之一[1]。在snoRNP复合物中,snoRNA通过碱基互补原理识别rRNA上的特定位点,引导复合物对这些位点进行2'-O甲基化和假尿嘧啶化修饰。在脊椎动物中,核仁小RNA的编码基因主要位于蛋白编码基因的内含子区,其转录产物经转录后加工形成成熟的核仁小RNA[2]。snoRNA参与多种生物学过程,包括rRNA的加工处理,RNA剪接和翻译,以及对氧化应激反应的调控[3]。根据snoRNA结构与功能的不同,可将snoRNA分为两大类:负责2'-O甲基化的boxC/DsnoRNA和负责假尿嘧啶化的boxH/ACAsnoRNA[1]。另外,还存在一类比较特殊的snoRNA—scaRNAs。scaRNAs特异表达于细胞核的Cajal小体,具有类似的C/Dbox或H/ACAbox结构[4]。snoRNA还产生类似miRNA的短片段非编码RNA,可与AGO蛋白结合并识别靶向mRNA序列,调控其翻译过程[5]
     多项研究表明,snoRNA在肿瘤中异常表达,并在肿瘤转移过程中扮演着重要角色。有些snoRNA可作为肿瘤促进剂或抑制剂发挥功能[6-7]。例如,SNORD50A/B具有结合K-Ras并抑制其活性的功能,常在癌症中发生缺失突变[8];SNORD44(RNU44)和SNORD43(RNU43)与乳腺癌的不良预后有关[9];SNORA80E(SNORA42)在肺癌中作为癌基因存在,抑制SNORA42的表达能够产生明显的抗癌作用[10]。C/DBox类snoRNAs在癌症中普遍高表达[11]。此外,snoRNA在神经退行性疾病的发生发展过程也发挥着关键作用。

nrStar™HumanFunctionalLncRNAPCRArray服务列表
C/DBOX213
SNORD4A;SNORD5;SNORD6;SNORD7;SNORD8;SNORD9;SNORD10;SNORD119;
SNORD121A;SNORD121B;SNORD123;SNORD124;SNORD126;SNORD127;SNORD1A;
SNORD1B;SNORD1C;SNORD2;SNORD101;SNORD102;SNORD103;SNORD103B;SNORD104;
SNORD105;SNORD105B;SNORD12C;SNORD13;SNORD14A;SNORD14B;SNORD15A;SNORD15B;
SNORD16;SNORD18A;SNORD18B;SNORD18C;SNORD20;SNORD21;SNORD22;SNORD24;SNORD25;
SNORD26;SNORD27;SNORD28;SNORD3;SNORD30;SNORD31;SNORD32A;SNORD32B;SNORD33;
SNORD34;SNORD35A;SNORD35B;SNORD36A;SNORD36B;SNORD36C;SNORD37;SNORD38A;S
NORD38B;SNORD41;SNORD42A;SNORD42B;SNORD43;SNORD4B;U97;SNORD96B;SNORD96A;
SNORD95;SNORD94;SNORD86;SNORD84;SNORD83B;SNORD83A;SNORD117;SNORD82;SNORD81;
SNORD80;SNORD118;SNORD78;SNORD77;SNORD76;SNORD75;SNORD73a;SNORD63;SNORD62B;
SNORD61;SNORD60;SNORD59B;SNORD59A;SNORD58B;SNORD58C;SNORD57;SNORD56;SNORD55;
SNORD54;SNORD53;SNORD52;SNORD51;SNORD50;SORD50B;SNORD48;SNORD47;SNORD46;
SNORD45A;SNORD45B;SNORD45C;SNORD44;SNORD12;SNORD12B;SNORD112;SNORD113-1;
SNORD114-1;SNORD17;SNORD19;SNORD19B;SNORD23;SNORD65;SNORD66;SNORD67;
SNORD88A/B/C;SNORD68;SNORD69;SNORD70;SNORD71;SNORD72;SNORD85;SNORD87;
SNORD90;SNORD91A;SNORD91B;SNORD92;SNORD93;SNORD98;SNORD99;SNORD100;
SNORD109A/B;SNORD115-1;SNORD110;SNORD111;SNORD111B;SNORD116-1;SNORD11;SNORD11B;SNORD12;SNORD12B;SNORD113-2;SNORD113-4;SNORD113-5;
SNORD113-6;SNORD113-7;SNORD113-8;SNORD113-9/SNORD113-3;SNORD114-10/18;
SNORD114-11;SNORD114-12/14;SNORD114-13;SNORD114-15/3/5/21/23/25/26;
SNORD114-17/4;SNORD114-19;SNORD114-2;SNORD114-20/21/22/28;SNORD114-24;SNORD114-29/30;SNORD114-31;SNORD114-6/9;SNORD114-7;SNORD115-11;SNORD115-12;SNORD115-17/18/23;SNORD115-27/29/30;SNORD115-28;SNORD115-36;SNORD115-37;SNORD115-48;SNORD116-11;SNORD116-12/16/17/18/21/22/24;SNORD116-13/14/15/20;SNORD116-19;SNORD116-23;SNORD116-25/26;SNORD116-27/29/30;SNORD116-28;SNORD116-5;SNORD116-6;SNORD116-9;SNORD79;SNORD58A;SNORD49A;SNORD49B;SNORD45BL2;SNORD42BL1;SNORD3@L39;SNORD3@L19;SNORD118L14;SNORD3L3;
SNORD118L11;SNORD68L1;SNORD118L9;SNORD3@L37;SNORD74L5;SNORD45BL1;SNORD65L2;SNORD23;SNORD38BL3;SNORD44L1;SNORD74L4;SNORD45BL3;SNORD56L7;SNORD77L3;SNORD41L1;SNORA25L14;SNORD75L2;SNORD114-15L1;U3.41-201;SNORD53L1;SNORD55L1;SNORD62BL1;SNORD51L1
 
H/ACABOX122
SNORA10;SNORA13;SNORA14A;SNORA14B;SNORA15;SNORA16;SNORA17;SNORA18;SNORA19;SNORA21;SNORA22;SNORA23;SNORA24;SNORA25;SNORA28;SNORA3;SNORA2B;SNORA45;SNORA30;SNORA31;SNORA33;SNORA34;SNORA36;SNORA36B;SNORA37;SNORA38;SNORA39;SNORA4;SNORA41;SNORA42;SNORA43;SNORA44;SNORA46;SNORA48;SNORA49;SNORA5A;SNORA50;SNORA51;SNORA52;SNORA53;SNORA54;SNORA55;SNORA56;SNORA58;SNORA59;SNORA5B;SNORA5C;SNORA6;SNORA60;SNORA61;SNORA77;SNORA80;SNORA80B;SNORA7A;SNORA8;SNORA9;SNORA62;SNORA63;SNORA47;SNORA35;SNORA26;SNORA11B;SNORA11D;SNORA11E;SNORA36C;SNORA38B;SNORA84;SNORA11;SNORA12;SNORA73A;SNORA73B;SNORA74A;SNORA74B;SNORA64;SNORA65;SNORA66;SNORA67;SNORA70;SNORA70B;SNORA70C;SNORA70D;SNORA70E;SNORA70F;SNORA71A;SNORA71B;SNORA72;SNORA99;SNORA71D;SNORA20;SNORA27;SNORA29;SNORA32;SNORA40;SNORA78;HBI-61;SNORA11C;SNORA68;SNORA69;SNORA16B;SNORA1;SNORA72L7;SNORA64L2;SNORA18L1;SNORA62L2;AL137790.4;SNORA11DL1;SNORA51L11;SNORA10L1;SNORA12L2;SNORA11EL1;SNORA70BL6;SNORA20L1;SNORA63L9;SNORA18L2;SNORA20L4;SNORA11BL2;SNORA67L1;SNORA32L2;SNORA2AL1;SNORA43L2;SNORA12L1;SNORA62L4
 
Cajalbody-specificscaRNAs24
SCARNA18;HTR;HBII-382;SCARNA13;SCARNA8;SCARNA17;SCARNA7;SCARNA12;SCARNA6;SCARNA5;SCARNA10;SCARNA14;mgU2-25/61;SCARNA9;mgU12-22/U4-8;HBI-100;ACA68;ACA66;SCARNA11;SCARNA16;SCARNA1;SCARNA4;SCARNA23;SCARNA22

芯片特点
• 最佳覆盖范围—同一块384孔板上覆盖了snoRNA,snoRNA靶向snRNA以及snoRNP复合物成员,是目前市场上覆盖度最高的PCR芯片
• 无与伦比的灵敏度–只需50ng总RNA,无需扩增
• 稳定有效的PCR引物–所有引物均在不同的细胞组织样本中通过严格验证
• 简单快速–无需扩增,只需将反转好的cDNA与SYBR®Greenmastermix混合加入到板中,然后运行qPCR,4小时内即能得到实验结果
• 疾病分子标志物筛选–高覆盖度、灵敏度、准确率以及高通量使其成为疾病分子标志物筛选与验证的首选

PCR芯片所包含的snoRNA列表
SnoPY:http://snoopy.med.miyazaki-u.ac.jp/
snoRNA-LBME-db:https://www-snorna.biotoul.fr//
 
服务名称芯片规格描述
nrStar™HumansnoRNAPCRArrayServicenrStar™HumansnoRNAPCRArray384-wellplate359条snoRNA,7条snoRNA靶向snRNA和4条snoRNPs复合物成员mRNA

PCR芯片实验流程
1. RNA抽提与质量检测
进行RNA常规抽提,使用NanoDropND-1000检测RNA浓度和纯度,使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。详细的样品QC结果见Arraystar服务报告。
2. cDNA合成
每样本取1.5μgRNA,使用rtStar™First-StrandSynthesisKit(Cat#AS-FS-001,Arraystar)试剂盒合成cDNA第一链。详细步骤参照Arraystar产品操作手册。
3. Real-timePCR扩增
将cDNA与ArraystarSYBRGreenqPCRMasterMix(Cat#AS-MR-005-5,Arraystar)混合,加入至384孔板中,在ABI7900PCR仪上进行Real-timePCR扩增。
4. 熔解曲线分析与原始数据导出
PCR扩增完成后,进行熔解曲线分析,使用PCR仪自带软件导出原始数据。出具RawData文件夹,包含原始Ct值、PCR扩增曲线图和熔解曲线图。

PCR芯片数据分析流程
1. PCR芯片数据质控
质控参数:Ct(Blank)>35;Ct(GDC)>35;Ct(RNASpike-in)<25;Ct(PPC)<25.符合上述条件的样本进入下一步分析。
2. 数据校正与△Ct值计算
板间校正:使用Ct(PPC)对不同PCR板进行板间校正。
内参校正与△Ct值计算:挑选最优内参,使用内参均值计算△Ct值。
3. 差异倍数计算(2^(-△△Ct))
使用△△Ct方法计算不同样品组之间的表达差异倍数。
4. P值计算
对样本组进行t检验,计算P值。
5. 其他常规数据分析
散点图分析;火山图分析;TOP20表达上调和下调snoRNA柱形图分析
6. 提供服务报告与数据分析结果
a. Arraystar服务报告(包括RNA样本QC和详细实验数据分析步骤)
b. Excel芯片结果汇总表(包括snoRNA列表,数据分析结果和各类图表)
c. RawData文件夹(包含原始数据、扩增曲线图和熔解曲线图)

ArraystarsnoRNAPCR芯片服务部分结果展示
1. 差异表达snoRNA列表(默认筛选参数:差异倍数>2;P<0.05,客户可指定筛选参数值)


2. 散点图(黑色斜线代表差异倍数为1,红色斜线代表差异倍数为2)


3. 火山图(黑色垂线代表差异倍数为1;粉色垂线代表上调或下调倍数为2;蓝色水平线代表P值为0.05)


4. TOP20表达上调snoRNA柱状图


5. TOP20表达下调snoRNA柱状图


参考文献
1. EstellerM.(2011)"Non-codingRNAsinhumandisease."Nat.Rev.Genet.12(12):861-74[PMID:22094949]
2. RichardP.andT.Kiss(2006)"IntegratingsnoRNPassemblywithmRNAbiogenesis."EMBORep.7(6):590-2[PMID:16741502]
3. WilliamsG.T.andF.Farzaneh(2012)"AresnoRNAsandsnoRNAhostgenesnewplayersincancer?"Nat.Rev.Cancer12(2):84-8[PMID:22257949]
4. DarzacqX.etal.(2002)"Cajalbody-specificsmallnuclearRNAs:anovelclassof2'-O-methylationandpseudouridylationguideRNAs." EMBOJ.21(11):2746-56[PMID:12032087]
5. EnderC.etal.(2008)"AhumansnoRNAwithmicroRNA-likefunctions."Mol.Cell32(4):519-28[PMID:19026782]
6. NallarS.C.andD.V.Kalvakolanu(2013)"RegulationofsnoRNAsincancer:closeencounterswithinterferon."J.InterferonCytokineRes.   33(4):189-98[PMID:23570385]
7. MannoorK.etal.(2012)"SmallnucleolarRNAsincancer."Biochim.Biophys.Acta1826(1):121-8[PMID:22498252]
8. SiprashviliZ.etal.(2016)"ThenoncodingRNAsSNORD50AandSNORD50BbindK-Rasandarerecurrentlydeletedinhumancancer."Nat.Genet.48(1):53-8[PMID:26595770]
9. GeeH.E.etal.(2011)"Thesmall-nucleolarRNAscommonlyusedformicroRNAnormalisationcorrelatewithtumourpathologyandprognosis."Br.J.Cancer104(7):1168-77[PMID:21407217]
10. MeiY.P.etal.(2012)"SmallnucleolarRNA42actsasanoncogeneinlungtumorigenesis."Oncogene31(22):2794-804[PMID:21986946]
11. SuH.etal.(2014)"ElevatedsnoRNAbiogenesisisessentialinbreastcancer."Oncogene33(11):1348-58[PMID:23542174]
C/DBOX213
SNORD4A;SNORD5;SNORD6;SNORD7;SNORD8;SNORD9;SNORD10;SNORD119;
SNORD121A;SNORD121B;SNORD123;SNORD124;SNORD126;SNORD127;SNORD1A;
SNORD1B;SNORD1C;SNORD2;SNORD101;SNORD102;SNORD103;SNORD103B;SNORD104;
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